基于东说念主类淋巴类器官模子揭示B细胞的复杂反应
抗体是在淋巴组织的生发中心（GCs）内启动B细胞分化为浆细胞时产生的。接受灵验免疫诊治的B细胞淋巴瘤患者发达出抗体产生减少，导致感染率较高和疫苗遵循缩小，即使在B细胞复原后亦然如斯。现时的体外模子不成督察始终的GC反应，也不成灵验地测试B细胞反应。
来自好意思国佐治亚理工学院Ankur Singh团队商议开发了模拟淋巴组织微环境的合成水凝胶，使来自东说念主类扁桃体和外周血单个核细胞起头的B细胞的GCs成为可能。起头于外周血单个核细胞的免疫类器官比起头于扁桃体的免疫类器官督察GC B细胞和浆细胞的时分更长，并发达出私有的B细胞编程，包括GC区室、体细胞超突变、免疫球卵白类别切换和B细胞克隆。化学扼制转录和表不雅遗传进程可增强浆细胞的酿成。自然在淋巴样器官芯片中整合极化的CXCL12卵白不错迁移健康供体B细胞的GC反应，但对于来自淋巴瘤患者的B细胞不起作用。该商议的系统以对免疫交代和B细胞芜乱进行快速、可控的建模。
著作先容
题目：东说念主类免疫类器官解码健康供体和淋巴瘤患者的B细胞反应 杂志：Nature Materials 影响因子：37.2 发表时分：2024年11月#1
商议配景
Background
B细胞熟谙和抗体产生是成效防患传染病的打算。受损的抗体反适时常见于癌症患者、老年东说念主和慢性感染患者，会导致B细胞耗竭。与健康对照者比较，淋巴瘤患者对致命感染的抗体反应昭着较低。在疫苗接种前一年内由CD20单克隆抗体指导的诊治和轮回B细胞的数目可权衡诊治患者疫苗交代的成效，但对免疫失调影响临床散伙的机制知之甚少。因此，关键需要开发东说念主类免疫技巧，以权衡免疫反应交代随时分推移的变化，并为B细胞耗竭诊治后复原的患者导致B细胞失调的机制提供观点。
淋巴组织内的B细胞活化区是B细胞际遇抗原并通过滤泡外反应或GC反应分化为抗体分泌细胞（ASCs）的特殊生态位。GC反应在体细胞超突变（SHM）和亲和熟谙后确立了执久的免疫，将启动B细胞分化为浆细胞。严立场控的GC反应需要在CXCL12等趋化因子作用下规章B细胞在卵泡内的带领。可是，由于启动GC B细胞的快速丢失以及需要复杂的转录和表不雅遗传变化，体外复制GC是具有挑战性的。自然基于matrigel基质胶的扁桃体类器官主要聚首于上皮感染，但基于transwell的扁桃体细胞结合体已讲授在疫苗产生交代中酿成GC。尽管如斯，扁桃体退却易获取，而况浮现于口腔微生物中，现存的模子需要特定性T细胞。现时的扁桃体模子莫得捕捉到淋巴组织微环境（包括细胞外基质和组织硬度）对GC B细胞反应的影响，也莫得捕捉到趋化因子梯度对B细胞极化和熟谙的影响。此外，现时的系统不成促进抗CD20诊治淋巴瘤幸存者B细胞的GC反应。从淋巴瘤幸存者身上网罗扁桃体、淋奉承或脾脏样本是不可行的，相称是如果有好奇钦慕监测归并供体在一段时老实的劣势复原情况，因此需要从更容易获取的起头获取淋巴样器官，如外周血单个核细胞（PBMCs）。
这项商议对淋巴组织进行表征以开发基于水凝胶合成的淋巴样器官，还分析细胞足迹、细胞外基质要素和力学特质。与扁桃体起头的类器官比较，该商议的生物工程PBMCs养殖的淋巴样器官炫耀出更执久的GC和浆细胞交代，为足够性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）幸存者对流感疫苗的GC反应受损提供了有价值的观点。通过将基质引发的极化CXCL12散布整合到微流控淋巴样器官芯片中，该商议成效地迁移了光区和暗区表型的空间区室化，这一征象在淋巴瘤患者B细胞酿成的类器官中莫得不雅察到。经过工程调动的类器官促进了抗体的快速产生和由劣势B细胞进程引起的疾病的建模，记号着免疫学商议和诊治发展的紧要当先。
#2
商议想路
Methods
哄骗合成的PEG-4MAL水凝胶构建了一个与自然淋巴组织相似的微环境。； 使用了流式、单细胞RNA测序和免疫荧光等技巧评估GC结构的酿成和特质； 考据淋巴类器官系统的灵验性以提供灵验用具。#3
关节商议散伙
Results
1.模拟淋巴细胞的水凝胶可擢升B细胞的存活率，以及PEG大分子大小和类型迁移东说念主B细胞存活
扁桃体组织切片的轮回免疫荧光炫耀增殖的B细胞(CD20+Ki67+)被细胞外基质(胶原I+)、T细胞(CD4+)和滤泡树突状细胞(FDCs)包围。使用原子力显微镜量化三个供体极新分离的扁桃体组织的硬度，扁桃体刚度在名义和组织里面的各个点上从120到2800 Pa不等。固定卵白酶敏锐交联剂(VPM)和不可降解交联剂(DIT)浓度的水凝胶的储存模量跟着PEG-4MAL的分量百分比的增多而增多，分别为(518±42) Pa (7.5%)和(1.075±76) Pa (12%)，耗损模量也有肖似的变化趋势。接下来比较了可溶性重组CD40L和抒发CD40L的成纤维细胞手脚T细胞模拟物(CD40L-TCM)对B细胞的激活作用。将200,000个新分离的扁桃体细胞的核部分用可溶性CD40L或CD40L-TCM包裹在20 μl的7.5 wt% PEG-4MAL (10 kDa)水凝胶中，并置于96孔板中。IL-4 (20 ng/ml)和B细胞活化因子(BAFF 100 ng/ml)添加4天。流式细胞术炫耀，CD40L-TCM可使扁桃体单核细胞活力擢升11.7±2.3倍，可溶性CD40L可使扁桃体单核细胞活力擢升1.2±0.3倍，标明膜结合CD40L-TCM比可溶性CD4OL更灵验地擢升细胞活力。加入东说念主类扁桃体起头的FDCs (HK-FDCs)，导致活扁桃体单核细胞的密度依赖性增多，每个水凝胶含有40,000个HK-FDCs，达到77.9±4.5%的B细胞存活。在不同PEG-4MAL质地百分比下，罗致PEG-4MAL/粘附肽/总交联剂的摩尔比分别为4:1:1.5和4:1:3.0来测试两种交联密度。4:1:15水凝胶浓度为7.5 wt%，在第4天权臣增多GC B细胞（Live+CD19+CD27+CD38+）和抗体分泌细胞（ASCs: Live+CD19+CD38+CD27+CD138+）。共聚焦成像相沿这些散伙，阐明了最好配方：7.5% PEG-4MAL水凝胶，摩尔比为4:1:1.5，完了~ 500pa的存储模量（图1）。
尽管PEG-4MAL和PEG-4VS的储存模量在20 kDa之间相似，但与PEG-4MAL凝胶比较，PEG-4VS凝胶的凋一火B细胞百分比（72±0.6%）卓越20倍。此外，PEG-4VS凝胶的GCB细胞数目（Live+CD19+CD38+CD27+）是PEG-4MAL凝胶的15倍。马来酰亚胺与硫代交联剂的快速反应能源学可能为启动B细胞创造更有益的环境。需要进一步的商议来了解每种制剂对B细胞反应的影响。组合包括GFOGERRGD、GFOGER+RDG（scrambled）、GFOGER+REDV和GFOGER+REDV+RGD，肽密度为3.7 mM。值得凝视的是，在较硬的7.5 wt% 10 kDa PEG-4MAL水凝胶中，与较软的7.5 wt% 20 kDa PEG-4MAL水凝胶比较，RGD和GFOGER共同导致GCE细胞和ASCs增多两倍。这种散伙昭着高于单独使用RGD、REDV或GFOGER。在GFOGER+REDV+RGD组中，使用α4β1扼制剂TR-140扼制REDV与整合素α4β1的互相作用，使GC B细胞复原到GFOGER+RGD组中所见的水平，标明REDV对GO B细胞反应有扼制作用（图1）。
图1
2.TLR7/8刺激增强B细胞对H1N1疫苗的反应，纯化启动B细胞抗原特异性GC反应
不雅察使用四种PBMC供体开发的类器官的供体依赖性反应。自然扫数供体均在24天内均发达出较长的交代，而H1N1+ R848在12天内诱导了四分之二供体的GC B细胞权臣增多。用HIN1+R848诊治24天后，三名供者的浆细胞反应增多。与扁桃体类器官和2D共培养比较，PBMC养殖的类器官发达出更多的抗原特异性反应，在第12和24天，H1N1+R848的酶联免疫吸附黑点（ELISpot）检测黑点均权臣高于H1N1单独或培养基组。来自4/5 PBMC供者的B细胞在浮现于H1N1+R848的类器官中的ELISpot计数高于单独感染H1N1的B细胞（。还不雅察到H1N1+R848处理的类器官中流感特异性IgG滴度昭着高于单独H1N1，4/5 PBMC供体诱导H1N1+R848浮现的类器官中流感特异性IgG分泌高于单独H1N1。用生物素结合H1N1-四聚体与FITC或链霉亲和素/Vio Bright 667妥洽进行的流式细胞术分析炫耀，与H1N1单独或R848单独比较，H1N1+R848权臣增强了抗原特异性GC细胞和浆细胞群。
临了，PBMC样本不错同期具有针对H1N1的稚童B细胞和驰念B细胞，而况驰念B细胞不错单独对R848刺激作出反应。使用启动B细胞分选试剂盒去除驰念B细胞，并与CD40L-TCM和FDCs培养启动(CD3+CD19+CD27)B细胞，以及BAFF、IL-4和IL-21细胞因子。不雅察到，与单独感染HIN1或单独感染R848比较，浮现于H1N1+R848的类器官中GCB细胞和ASCs增多，并诱导权臣较高的类别向lgG+ GCB细胞迁移（图2）。
图2
3.疫苗佐剂迁移类器官的基因组，以及RNA-seq炫耀时分B细胞和血浆熟谙
在H1N1浮现的类器官中，GSEA炫耀PBMC养殖的CD138+ B细胞中干扰素、炎症、Stat3/Stat5、PI3k-AKT-mTOR、胆汁酸和TNF信号上调，而E2F靶点和G2-M查验点下调。第12天，HIN1+R848下调干扰素、炎症、Stat3、PI3k-AKT-mTOR、胆汁酸和TNF信号传导。比较之下，在第24天，氧化磷酸化和DNA开导上调，而干扰素、炎症、Stat3/Stat5、PI3k-AKT-mTOR、E2F靶点、G2-M查验点以及NF-kB介导的mTOR信号和TNF信号下调。PBMC养殖类器官中TNF的增多可能解释了PBMC养殖ASCs性能的改善。
为判辨解类器官培养进程中B细胞的分化和同型或克隆异质性，在第4、12、16和24天对浮现于H1N1或浮现于H1N1+R848的培养物平分离的B细胞进行了单细胞RNA测序。UMAP炫耀六个不同的B细胞簇，在24天内炫耀了时分基因抒发万般性。簇2在第4天达到峰值，包括早期B细胞活化基因（CD40、BATF、CD69、ccr7和HMGB2）、增殖基因（EZH2、AICDA和AURKB）和GC B细胞分化基因。ASCs熟谙，以CD19下调为记号，CD19下调在2和3簇中权臣，但在4和5簇中较低，在0和1簇中不存在，标明浆细胞熟谙。ASC过渡阶段（簇4和5）在第12天至第24天之间演变为熟谙神气（簇0和1）。总的来说，这些发现标明PBMC-类器官起头的ASCs和浆细胞发达出好多肖似的XBPI、IRF4、PRDMI、CD27和CD19的特征性抒发（图3）。
图3
4.测序炫耀类别切换和克隆扩增，以及BCR测序揭示类器官中的SHM
使用B细胞受体（BCR）测序进行免疫球卵白类切换分析，比较HIN1和HIN1+R848，发当今0和1簇中，类切换到IgG1 BCR的上风，其中HIN1+R848比HIN1炫耀更多的IgG1。凝视到IgM的徐徐减少和IgG1抒发的增多，从簇2到簇5，在簇2中IgM的高抒发。与单独的H1N1比较，H1N1R848增多了簇0和簇5中IgG1和IgG2的水平。比较之下，簇6中HIN1单独炫耀IgG2上风，而H1N1 +R848诱导的类迁移为IgG1、IgG2和IgG4。此外，由浆细胞构成的簇0炫耀出最大的B细胞克隆扩增。在扫数时分点和委果扫数病毒群中，H1N1+R848诱导的克隆扩增比H1N1单株更多。抗体在亲和力熟谙进程中在其互补决定区（CDRs）积贮突变。SHM提供了对于ASCs熟谙的关键信息。扫数簇中重链CDRs和PBMC养殖B细胞的突变水平均炫耀SHM的凭据。相对于簇2和簇3中的活化B细胞和GC B细胞，簇0、1、4和5中的ASCs和浆细胞具有更高数目的重链CDR突变。总体而言，在ASCs和浆细胞簇中，HIN1+R848要求下的重链CDR突变数目高于单独H1N1要求下的数目。与不雅察到的免疫球卵白类别迁移一致，簇6在HIN1+R848要求下炫耀出比单独HIN1要求下更万般化的免疫球卵白类别迁移，也在HIN1+R848要求下炫耀出重链CDR突变。临了，在簇0、1、3和5中，CDR区域的突变在24天内徐徐增多，在第24天达到最高（图3）。
5.查验点扼制加快浆细胞分化
PBMC养殖类器官的单细胞RNA测序炫耀，EZH2在簇2和簇5中高水平抒发。此外，BCL6在簇2中抒发较高。假定在类器官GC反应的峰值扼制EZH2和BCL6会增多浆细胞的数目。在H1N1+R848中，不雅察到在PBMC养殖的类器官中，CD19+CD38+CD27+EZH2+ GC B细胞和EZH2的抒发与单独的HIN1比较权臣增多。在第12天，与单独使用HIN1比较，使用HIN1+R848诊治可诱导更多的HIN1特异性CD38+CD27+BCL6+ GC B细胞。从视觉上看，与单独浮现于H1N1的类器官比较，用H1N1+R848处理的类器官在CD20+ B细胞中炫耀出更高的BCL6抒发。在接下来的48小时内，在第12天扼制EZH2、BCL6或两者。与对照组比较，BCL6扼制剂或BCL6和EZH2扼制剂妥洽使用在第16天和第24天诱导的GC B细胞权臣减少。比较之下，添加这两种扼制剂在第16天和第24天诱导的CD19+CD138+浆细胞数目是无扼制剂对照组的两倍。在第24天，不雅察到使用这两种扼制剂的组中有更高的抗原特异性分泌IgG，这标明血清抗体分泌能源学相对于表型发育延长。还不雅察到，在第16天神用这两种扼制剂后，暗区GC B细胞权臣减少，亮区GC B细胞权臣增多，标明GC的暗区和亮区之间的典型交换被马虎（图4）。
图4
6.PBMC类器官权衡癌症患者的免疫反应
不雅察到Fluzone在健康供体PBMC类器官中具有浩大的GC交代，而况与单独使用Fluzone比较，Fluzone妥洽R848增强了GCB细胞、ASCs、浆细胞和驰念B细胞的分化。诊治后9个月足下，B细胞占淋巴细胞的比例<1%。重组前（9-12个月），B细胞主若是CD19+IgD-CD27-双阴性驰念细胞。熟谙的稚童B细胞（CD19+IgD+CD27-）在9个月足下出现，随后是未开关的（IgD+CD27+），然后是开关的（IgD-CD27+）驰念B细胞。用Fluzone疫苗诊治的PBMC类器官的流式细胞术分析炫耀，与淋巴瘤患者比较，健康供者（n=8）的GCB细胞和浆细胞昭着更多。在体外，8例淋巴瘤病例中有6例比健康对照组产生更少的GCB细胞，权衡淋巴瘤患者的低、中、高疫苗交代。在扫数DLBCL样本中，浆细胞反应昭着较低。这反应了淋巴瘤患者对疫苗的全体免疫反应受损的临床发现，其中一些对健康个体的反应相似，而另一些则莫得反应。在其他供体中，基于第12天的ASC和浆细胞分化，Fluzone+R848在DLBCL患者类器官中诱导的GC反应昭着弱于健康供体类器官。此外，在DLBCL类器官中缺少R848的额外交代标明佐剂交代受损。6种血清型DLBCL类器官中IgG血清抗体水平权臣缩小（图5）。
图5
7.具有迁移光/暗区的淋巴器官芯片，以及癌症幸存者的B细胞失去了空间区隔
在体内，基质细胞通过分泌趋化因子如CXCL12来促进GCs中明暗区的空间组织。假定基于微流体的CXCL12梯度不错规章淋巴样器官的亮区和暗区结构的分离，哄骗微通说念开发淋巴细胞包封水凝胶的芯片上淋巴器官，并在PEG-4MAL水凝胶为基础的B细胞类器官上极化散布CXCL12。基于水凝胶的类器官通过安设中部直径4 mm的孔在芯片上原位交联。FITC偶联牛血洁白卵白（FITC-BSA）在PEG-4MAL水凝胶中的散布呈极化散布，在生理盐水中，FITC-BSA聚首在高流量的A角落，而在B角落减少。在缺少CXCL12的情况下，扁桃体类器官的暗区和亮区GC B细胞立地散布。当CXCL12在X标的发生空间极化时，CXCR4+B细胞向左移动，而CXCL12在Z标的发生空间极化时，CXCR4+B细胞被引诱到顶部。PBMC不异被分离为不同的暗区和亮区隔室。定量分析炫耀，在三个PBMC供体和两个重叠中，XCR4+细胞在趋化因子梯度下一致向左半圆极化。与莫得趋化因子梯度的安设和莫得趋化因子的安设比较，CXCL12趋化因子的极化散布增多了上清中IgGl抗体的产生。比较之下，细胞因子的产生受到CXCL12存在的影响，而不受梯度的影响。与不含趋化因子的安设比较，CXCL12趋化因子的极化散布权臣增多了IL-6L、IL-12p70、TNF-α、IFNγ、IL-2、IL-10、IL-17、APRIL和TNF-β的产生。
进一步不雅察到CD4+T细胞在CXCR4极化空间中的空间定位，位于器件的CXCL12高区域，标明淋巴样器官芯片模拟了体内GC生物学。还商议了DLBCL患者养殖的PBMC中GC B细胞的酿成受损是否由于酿成区隔结构的末端。值得凝视的是，当浮现于Fluzone+R848时，与健康供体PBMC不同，在96孔板中培养的PEG-4MAL类器官中的DLBCL患者起头的PBMC不会酿成肖似明暗区域的簇。在具有极化CXCL12趋化因子的淋巴样器官芯片模子中，DLBCL养殖的B细胞也不成像健康的B细胞一样区隔。定量分析炫耀，在健康供体中，在三个供体中以及在设备重叠之间，CXCR4+细胞向高CXCL12区域的极化一致，但在淋巴瘤供体中则莫得。这标明化疗后的B细胞可能会失去酿成必要区室的能力，从而潜在地挫伤体液免疫（图6）。
图6
小结
开发体外免疫反应模子具有挑战性，因为它必须模拟B细胞熟谙并权衡探讨患者东说念主口统计学和疾病现象的疫苗反应。该商议发现PBMC养殖的类器官相沿细胞亚群的寿命，并提供了一个适宜的平台来商议相对于会诊和癌症定向诊治的淋巴瘤患者跟着时分的推移遏抑变化的GC反应。这种门径不错通过识别有不良疫苗反应风险的患者并相应地调整阻拦格式，权臣改善B细胞猝然诊治后的临床处理。该职责强调了使用启动B细胞与CD40L细胞发展隆重的GC表型的后劲，即使在莫得TFH细胞的情况下。将来的工程系统不错促进用户规章的亲和熟谙，通过识别免疫原性表位和佐剂或产生单克隆抗体来增强疫苗设想。此外，淋巴器官芯片不错与多器官系统集成，模拟通盘东说念主体复杂的免疫互相作用，为更全面和权衡性的东说念主体免疫反应商议铺平说念路。
参考文件
Zhong Z, Quiñones-Pérez M, Dai Z, Juarez VM, Bhatia E, Carlson CR, Shah SB, Patel A, Fang Z, Hu T, Allam M, Hicks SL, Gupta M, Gupta SL, Weeks E, Vagelos SD, Molina A, Mulero-Russe A, Mora-Boza A, Joshi DJ, Sekaly RP, Sulchek T, Goudy SL, Wrammert J, Roy K, Boss JM, Coskun AF, Scharer CD, García AJ, Koff JL, Singh A. Human immune organoids to decode B cell response in healthy donors and patients with lymphoma. Nat Mater. 2024 Nov 6. doi: 10.1038/s41563-024-02037-1. Epub ahead of print. PMID: 39506098.
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